Как хранить пептиды

Что на самом деле вызывает деградацию

Деградация пептидов определяется не только температурой. Три основные переменные определяют стабильность, и их относительная важность различается в зависимости от того, находится ли пептид в сухом виде или в растворе.

• Влага. Для лиофилизированных пептидов влага является наиболее важной переменной. Активность воды обеспечивает гидролиз, способствует окислительным реакциям и стимулирует рост микроорганизмов. Запечатанный флакон с низким остаточным содержанием влаги может сохранять стабильность в широком температурном диапазоне, поскольку сухое состояние подавляет практически все пути водного разложения. После вскрытия флакона или проникновения влаги стабильность снижается независимо от температуры.
• Свет и окисление. УФ-излучение и окружающий свет ускоряют окислительную деградацию специфических остатков. Метионин и триптофан особенно восприимчивы; пептиды, содержащие цистеин, также чувствительны из-за лабильности дисульфидных связей. Окислительное повреждение применимо как к сухим, так и к восстановленным пептидам, что делает защиту от света важной независимо от температуры хранения.
• Температура. Температура является значимой переменной, однако вторична по отношению к влаге для сухих пептидов. Более низкие температуры замедляют остаточные химические реакции, именно поэтому хранение в морозильнике продлевает срок годности, однако дополнительная польза заморозки по сравнению с хранением в холодильнике правильно запечатанного сухого флакона невелика в сравнении с пользой от простого исключения влаги. Для восстановленных пептидов в растворе температура становится более значимой, поскольку пути деградации уже активны; охлаждение существенно замедляет гидролиз и активность микроорганизмов.

Хранение лиофилизированных (сухих) пептидов

Лиофилизированный пептид в запечатанном сухом виде значительно стабильнее восстановленного раствора. Правильно лиофилизированный флакон с низким остаточным содержанием влаги может сохранять стабильность при контролируемой комнатной температуре (15-25°C) в течение недель и месяцев. Опубликованные данные по стабильности показывают, что скорости деградации некоторых лиофилизированных пептидов при 25°C в течение 12-24 месяцев не сильно отличаются от таковых при −20°C, когда влага, свет и окисление контролируются. Заморозка является консервативной лучшей практикой, обеспечивающей дополнительный запас надёжности, однако она не является строгим требованием для всех пептидов в любых условиях.

Основные принципы применяются независимо от места хранения:

• Флаконы должны быть постоянно герметично закрыты и защищены от влаги; это важнее, чем температурный режим.
• Флаконы должны быть защищены от прямого света и источников тепла.
• При совместном хранении нескольких флаконов помещайте в контейнер пакет с осушителем для поглощения атмосферной влаги.
• Не вскрывайте флакон до момента, когда будете готовы провести восстановление; контакт с воздухом вносит влагу и сокращает срок годности.
• Проверяйте герметичность флакона перед использованием; любые признаки нарушения целостности (трещины на пробке, ослабленная крышка) меняют картину стабильности независимо от температуры хранения.

Хранение восстановленных пептидов

После растворения пептида в бактериостатической воде его стабильность значительно снижается по сравнению с сухим порошком. Консервант бензиловый спирт в составе бактериостатической воды увеличивает срок годности, подавляя рост микроорганизмов, однако пептид уже находится в водном растворе и подвержен гидролизу, дезамидированию и окислительной деградации. После растворения пептида важны как температура, так и pH.

Большинство руководств по работе с исследовательскими материалами указывают, что восстановленный пептид в бактериостатической воде остаётся пригодным для использования в течение 28–30 дней при хранении в холодильнике. Ряд источников сообщает о сроке до 60 дней для более устойчивых пептидных последовательностей, однако консервативный 28-дневный период широко принят в качестве стандарта. По истечении этого срока эффективность препарата не может быть гарантирована.

pH и стабильность восстановленного пептида

После растворения пептида pH становится доминирующей переменной стабильности. Сухое состояние подавляло большинство путей деградации; в растворе они активны, и скорость их протекания сильно зависит от pH.

• Дезамидирование. Пептиды, содержащие аспарагин (Asn) или глутамин (Gln), склонны к дезамидированию, реакции, при которой амид боковой цепи преобразуется в карбоновую кислоту. Скорость зависит от pH: щелочные условия (выше pH 8) значительно ускоряют его, тогда как слабокислые условия (pH 4-6) существенно замедляют. Дезамидирование изменяет заряд и иногда биологическую активность пептида.
• Гидролиз. Пептидные связи могут гидролизоваться в растворе со временем. Кислые условия замедляют дезамидирование, но могут ускорять гидролиз некоторых пептидных связей, в особенности расположенных рядом с остатками аспартата. В целом умеренно кислый pH (4-6) является наилучшим компромиссом для большинства пептидов.
• Почему предпочтительны бактериостатическая вода и разбавленная уксусная кислота. Бактериостатическая вода имеет pH около 5,5, а разбавленная уксусная кислота около 3,5-4,5. Оба значения находятся в диапазоне, который замедляет дезамидирование, не вызывая агрессивного гидролиза. Обычная стерильная вода имеет непредсказуемый и нередко щелочной pH и не обеспечивает микробиологической защиты, именно поэтому для восстановления рекомендуются специфичные для пептида растворители, а не обычная вода. Некоторые пептиды, плохо растворимые в нейтральных водных средах, легко растворяются в разбавленной уксусной кислоте именно потому, что кислая среда сохраняет их в заряженной, растворимой форме.

Циклы заморозки и оттаивания

Каждый цикл заморозки-оттаивания подвергает раствор пептида механическому воздействию, обусловленному образованием кристаллов льда и их последующим растворением, что может постепенно снижать активность вещества. Поэтому следует минимизировать количество повторных циклов.

Если длительное хранение восстановленного пептида всё же требует заморозки, рекомендуется заблаговременно разделить раствор на аликвоты в объёмах разовых доз в небольших янтарных флаконах. При этом размораживается только количество, необходимое для конкретной сессии, что позволяет сохранить целостность остальных аликвот. Это особенно важно для пептидов с известной чувствительностью к температурным циклам.

Чувствительность к свету

УФ-излучение и окружающий свет ускоряют окислительную деградацию специфических аминокислотных остатков. Наиболее восприимчивы метионин и триптофан; фенилаланин и тирозин также подвержены воздействию. Как сухие, так и восстановленные пептиды следует хранить в янтарных (тёмных) стеклянных флаконах; при отсутствии янтарных флаконов флакон необходимо обернуть алюминиевой фольгой.

Не оставляйте восстановленный пептид на рабочем столе под прямым солнечным светом или под яркой лабораторной лампой на длительное время. При наборе дозы сводите к минимуму время, в течение которого флакон находится вне холодильника и без защиты от света.

Кратковременные нарушения температурного режима

Случайное кратковременное воздействие температур, выходящих за пределы целевого диапазона, например непродолжительное отключение электричества, влияющее на работу холодильника, как правило допустимо для лиофилизированного порошка. Поскольку основным риском деградации сухого пептида является влага, а не температура, несколько часов при комнатной температуре вряд ли существенно повлияют на нераспечатанный запечатанный флакон с целой упаковкой.

Восстановленный пептид, находившийся при комнатной температуре несколько часов, как правило, остаётся пригодным к использованию при условии, что общее время не превышает приблизительно 24 часов. Если восстановленный флакон простоял при комнатной температуре дольше этого срока, либо если раствор помутнел, изменил цвет или содержит видимые частицы, его следует утилизировать, а не использовать.

Советы для транспортировки

• По возможности перевозите лиофилизированный порошок. Сухой пептид значительно устойчивее при транспортировке, чем восстановленный раствор, и не требует непрерывного соблюдения холодовой цепи при коротких поездках при условии сохранения герметичности флакона.
• Используйте термоизолированный контейнер с хладоэлементом для любого восстановленного пептида, который необходимо транспортировать. Небольшие медицинские термосумки широко доступны и поддерживают температуру 2–8°C в течение нескольких часов.
• По возможности проводите восстановление по месту назначения. Если взять с собой сухой флакон и отдельный флакон с бактериостатической водой и провести восстановление по прибытии, можно полностью исключить необходимость соблюдения холодовой цепи.
• Служба безопасности в аэропорту: как правило, службы безопасности допускают провоз медицинских материалов, включая шприцы и флаконы, при наличии соответствующей документации. Требования варьируются в зависимости от юрисдикции, уточняйте их перед поездкой.

Распространённые ошибки

• Отношение к температуре как к единственной переменной хранения для сухих пептидов: запечатанный флакон с низким содержанием влаги стабилен в более широком температурном диапазоне, чем принято считать. Концентрация внимания на морозильнике при игнорировании влаги, света и целостности флакона упускает основные факторы риска.
• Хранение восстановленного пептида при комнатной температуре: даже несколько дней при комнатной температуре могут заметно снизить активность. Держите восстановленные флаконы в холодильнике в любое время, когда они не используются.
• Использование обычной стерильной воды для восстановления: обычная стерильная вода имеет непредсказуемый pH и не обеспечивает микробиологической защиты. Для большинства пептидов предпочтительна бактериостатическая вода или разбавленная уксусная кислота.
• Повторные циклы заморозки-оттаивания: каждый цикл разрушает раствор. Если требуется длительное хранение в замороженном виде, предварительно разделите препарат на аликвоты в объёмах разовых доз.
• Отсутствие маркировки флаконов с датой восстановления: без даты невозможно определить, находится ли флакон в пределах допустимого срока использования. Всегда маркируйте флакон сразу после восстановления.
• Оставление пептидов под воздействием света на рабочем столе: УФ-излучение вызывает фотодеградацию остатков метионина и триптофана. Храните препараты в янтарных флаконах или в фольге, минимизируя время нахождения под светом при подготовке доз.